摘要：在中国流行的非洲猪瘟病毒(ASFVs)基因组发生了遗传变化，这可能改变其抗原特性并导致免疫逃逸。异种分离株之间的交叉保护通常很差，因此，测试ASFV减毒活疫苗对当前流行的异种分离株的交叉保护是很重要的。在这项研究中，我们评估了ASFV候选疫苗HLJ/18-7GD对新出现的分离株的保护效果。HLJ/18-7GD提供了对高毒力变体和低致死分离株的保护，这两种变体均来自基因型II 乔治亚07样ASFV，并于2020年分离。接种HLJ/18-7GD可防止猪出现非洲猪瘟特异性临床症状和死亡，减少病毒通过口腔和直肠途径的脱落，并抑制病毒在感染后的复制。然而，在猪中接种HLJ/18-7GD疫苗对基因型I型NH/ p68样ASFV攻击没有提供坚实的交叉保护。因此，接种HLJ/18-7GD疫苗作为预防和控制基因型ASFV的替代策略具有很大的前景，但中国可能需要针对不同基因型ASFV提供交叉保护的疫苗。

结论：

一、中国非洲猪瘟病毒不同变异和基因型的出现

自2018年以来，非洲猪瘟病毒在中国的自然界中持续传播和进化，并在不同的非洲猪瘟病毒中发现了遗传变异，包括强毒基因型II病毒、中毒基因型II变异病毒、低毒基因型I病毒以及致死性基因型I和II重组病毒。

基因型病毒HuB/628/20于2020年在中国湖北省分离到，在猪中表现出与中国最早分离到的病毒HLJ/18相似的高致死率。为了描述HuB/628/20的遗传变化，我们使用先前描述的片段PCR策略对其全基因组进行了测序。序列数据已存入GenBank，登录号为OR126359。

与毒株HLJ/18的全基因组相比，HuB/628/20有10个核苷酸突变，导致6个病毒基因(MGF_110-1L、MGF_110-3L、MGF_110-4L、MGF_110-5L-6L、MGF_360-12L和QP383R)的6个氨基酸发生变化，在非编码区有一个C插入，涉及4个病毒基因(MGF_360-2L、MGF_360-7L、MGF_110-14L、MGF_360-2L、MGF_360-7L、MGF_110-14L)的8个位点有20个核苷酸缺失。(图1和表1)。我们的遗传分析显示，与早期分离的HLJ/18相比，流行的强毒基因型病毒HuB/628/20基因组发生了许多遗传改变。

基因型II型变异型HLJ/HRB1/20于2020年在中国黑龙江省分离到，由于其EP402R基因缺失25 nt导致CD2v蛋白表达失败，其在猪中的致死率低于HLJ/18, 10⁶ TCID₅₀剂量导致75%的猪死亡。与强毒株HLJ/18的全基因组相比，HLJ/ HRB1/20 (MW656282)有23个选择的orf或高频突变区域，EP402R基因缺失25个核苷酸，A238L基因缺失14个核苷酸，14个核苷酸突变导致8个病毒基因(MGF_110-1L, MGF_110-3L, MGF_110-4L, MGF_110-5L-6L, K205R, QP383R, E248R和E66L)的8个氨基酸变化，MGF_110-1L的短86个b置换，以及涉及5个病毒基因的7个位点51个核苷酸缺失(MGF_110-14L, ASFV-G-ACD-00350, A238L, EP153R，EP402R)(图1和表1)。

山东和河南分别于2021年田间检测到SD/DY-I/21和HeN/ZZP1/21基因型病毒[5]。全基因组序列系统发育分析显示，SD/DY-I/21 (GenBank: MZ945537)和HeN/ZZ-P1/21 (GenBank: MZ945536)与葡萄牙基因I型分离株NH/P68和OURT88/3属于同一进化支，与中国基因II型asfv不同。动物研究表明，基因I型NH/ p68样病毒SD/ DY-I/21毒力低，但在猪群中传播效率高，可引起皮肤坏死、关节肿胀等慢性临床症状。

二、减毒活疫苗候选HLJ/18-7GD诱导对流行的高毒力基因型II型HLJ/18样变体的攻击保护

为评价HuB/628/20基因的改变是否影响HLJ/18-7GD的保护能力，将5只7周龄SPF猪免疫接种10⁶ TCID₅₀的HLJ/18-7GD，然后在刺激后第28天免疫接种10^1.5 HAD₅₀的HuB/628/20。用相同剂量的HuB/ 628/20免疫攻毒4头未接种SPF猪作为对照。4头对照猪均表现出明显的ASF临床症状，并在攻击后第6天(p.c)出现发热，在第9天至第11天死亡(图2)。在免疫组中，3头接种HLJ/18-7GD的猪直肠温度正常，无任何临床体征，2头接种HLJ/18-7GD的猪从p.c第4天开始出现短暂发热。5头接种疫苗的猪均在28天的观察期存活(图2)。

在攻毒后的不同时间点采集口腔和直肠拭子和血液。在对照组猪中，从第5天开始在口腔拭子中检测到病毒DNA，从第3天开始在直肠拭子和血液中检测到病毒DNA，病毒DNA水平逐渐升高，直到猪死亡(图S1)。在接种疫苗的猪中，在第5天至第10天之间的4个口腔拭子和5个直肠拭子中检测到病毒DNA，在第5天至第15天之间的7个血液样本中检测到病毒DNA(图S1)。

在死亡对照猪的所有组织和淋巴结中检测到高病毒载量，而当接种疫苗的猪在第28天安乐死并切除其组织时，在检查的组织和淋巴结中未检测到病毒DNA。低水平的病毒DNA仅在一头猪的脾脏和肾脏以及两头猪的几个淋巴结中检测到(图2)。

肺、脾、肾、扁桃体、腹股沟淋巴结和颌下淋巴结的组织病理学分析显示，接种HLJ/ 18-7GD改善了组织病理学改变(图S2)。未免疫仔猪的组织表现出明显的病理改变，包括间质性肺炎，肺泡壁内炎症细胞密集浸润，脾实质红细胞积聚和白髓萎缩，肾脏炎症细胞出血和浸润，扁桃体淋巴细胞坏死(图S2)。未免疫仔猪淋巴结节结构模糊，腹股沟淋巴结和颌下淋巴结淋巴细胞明显减少和坏死(图S2)。然而，在免疫后的猪中，除了在肺部观察到轻度至中度间质性肺炎外，没有明显的病理改变(图S2)。这些结果表明，HLJ/18-7GD诱导了一种流行的高毒力HLJ/18样变体对攻击的保护作用。

三、HLJ/18-7GD具有较低致死性基因型HLJ/18样变异的有效保护作用

为了研究HLJ/18-7GD是否能诱导对新出现的低致死基因型ASFV变体的保护作用，本实验对5头7周龄SPF猪进行了免疫。

用HLJ/18-7GD 10⁶ TCID₅₀免疫，然后在第28天下午3点用HLJ/HRB1/ 20 10⁶ TCID₅₀免疫。4只对照猪免疫相同剂量的HLJ/HRB1/20病毒。每天记录直肠温度、存活率和临床症状，包括厌食、平躺、皮疹和关节肿胀，持续28天。然后使用先前描述的评分系统对每头猪的每日临床评分进行汇总，并进行轻微修改。在对照组中，一只猪从第9天开始发烧，从第8天开始出现高临床评分和抑郁，并在第11天死亡。

另一头对照猪在第4天开始发烧，从第13天开始出现高临床评分和抑郁，分别在第19、20和21天出现肿块、皮肤坏死和关节炎，并在第22天死亡(图3和表2)。

其余两只对照猪在观察期间存活，尽管其中一只从第7天开始出现发烧，从第11天开始出现高临床评分和抑郁，并从第22天开始出现关节炎(图3和表2)。

接种组猪无发热及任何慢性临床症状，28 d观察期全部存活(图3、表2)。

在攻毒后的不同时间点采集口腔和直肠拭子和血液。即使在第28天，在对照猪的口腔和直肠拭子和血液中也随机检测到病毒DNA(图4)。在第6天之前，在两头接种猪的三个拭子中检测到低水平的病毒DNA，而在接种猪的血液中未检测到病毒DNA(图4)。

尸体解剖是在死亡或安乐死时进行的。观察各脏器及淋巴结的大体病变情况。对照组部分猪出现组织病变，如前所述，包括毛心、心包积液、浆膜、扁桃体损伤和淋巴结充血，而接种HLJ/ 187gd组的猪仅出现轻度淋巴肿大和淋巴结出血(数据未显示)。肺、脾、肾、扁桃体、腹股沟淋巴结和颌下淋巴结的组织病理学分析显示，接种HLJ/18-7GD可预防其组织病理学损伤(图S3)。未免疫仔猪的组织表现出显著的变化，包括肺泡壁增厚和肺部炎症细胞密集浸润，脾脏淋巴细胞数量减少和红细胞积聚，肾脏多灶性间质出血，扁桃体弥漫性淋巴细胞减少，腹股沟淋巴结和颌下淋巴结严重充血，淋巴细胞坏死和淋巴细胞减少(图S3)。然而，除了上颌下淋巴结反应性淋巴细胞增生外，免疫仔猪组织的组织学特征保持正常(图S3)。

在所有4只对照猪的组织和淋巴结中检测到高水平的病毒DNA(图4)，但在3只接种猪的4个淋巴结样本中检测到极低水平的病毒DNA(图4)。这些结果表明，HLJ/18-7GD诱导了猪对自然发生的低毒力变异的有效保护，减少了病毒在体内的脱落和复制，并防止了慢性抑郁症临床症状的发展。关节炎、肺肿和皮肤坏死

四、HLJ/18-7GD疫苗会使猪对I基因型低毒ASFV产生较差的交叉保护

为了研究HLJ/18-7GD是否能诱导对基因型NH/ p68样asfv的交叉保护，将5头7周龄SPF猪接种10⁶ TCID₅₀的HLJ/18-7GD，然后进行免疫。

在第28天，用基因型1分离株SD/DY-I/21的10⁶ TCID₅₀攻毒。四头年龄相匹配的未接种疫苗的猪同样受到攻毒作为对照。

攻毒后28 d，每天对所有猪进行监测。在对照组中，一些猪从第4天开始发烧。临床症状逐渐出现，直到观察期结束，但发热主要发生在第4天至第14天，所有猪的直肠温度从第15天开始正常(图5)。对照猪2头从第19天开始出现皮肤坏死，所有猪均出现抑郁、关节炎和肿块。但在28天的观察期均存活(图5和表2)。接种疫苗的猪从第4天开始出现间歇性咳嗽和厌食等临床症状，从第10 - 19天开始出现较高的临床评分(图5)。所有接种疫苗的猪的直肠温度从第10天开始升高9天，从第20天恢复正常(图5)。或皮肤坏死(图5和表2)。接种疫苗的5头猪中有1头在第18天死亡，但其余猪在28天的观察期存活(图5)。

在攻毒后的不同时间点以5天的间隔收集口腔和直肠拭子和血液。在对照组中，从第10天开始在口腔和直肠拭子中检测到病毒DNA，从第5天开始在血液中检测到病毒DNA，直到观察期结束(图6)。从第15天开始，在两只接种疫苗的猪的口腔拭子中检测到病毒DNA;在第15天从一头猪的直肠拭子中;在所有对照猪的组织和淋巴结中检测到病毒DNA，但在所有接种猪的肝脏、肾脏或肠淋巴结中未检测到病毒DNA(图6)。在一只接种猪的脾脏和三只接种猪的肺部检测到较高水平的病毒DNA(图6)。接种HLJ/18-7GD抑制了组织病理学肺损伤(图S4)。未接种的仔猪表现为严重的局限性肺间质性肺炎，其特征是肺泡间隙完全闭塞，肺泡内炎症细胞密集浸润，并且上皮细胞异常增生。值得注意的是，免疫仔猪的肺部没有明显的病理改变迹象。免疫猪和对照组的腹股沟淋巴结均出现淋巴减少(图S4)。然而，免疫组或对照组的脾脏、肾脏、扁桃体或颌下淋巴结未见明显病理变化(图S4)。结果表明，HLJ/18-7GD不能诱导猪对基因型低毒ASFV的交叉保护，但可以防止慢性症状的发生。

讨论：

自2018年以来，非洲猪瘟病毒2型在中国地区传播和演变。随后，鉴定出具有中等毒力的基因II型变异体和具有不同毒力的基因I型病毒。评估非洲猪瘟候选疫苗对当前流行的非洲猪瘟病毒的保护效果至关重要。在这项研究中，我们发现ASF候选疫苗HLJ/18-7GD对来自基因型II型乔治亚07样ASFV的高毒力变体和低毒力分离株具有坚实的保护作用，但对基因型I型NH/ p68样低毒力病毒的保护作用较差。非洲猪瘟病毒在自然界中不断传播和进化。因此，应开展广泛的流行病学研究，以了解非洲猪瘟病毒的演变和变异。此外，应及时评估候选疫苗对新出现变种的保护作用。

原文网址：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38164797/