各位小伙伴们大家好，我是专注于生信分析研究与实践的光宝呀~专为大家提供独特而前沿的研究选题、分析思路，人人可复现的双疾病热门领域生信文献就是今天的主菜！

最近向光宝求助的小伙伴可是不少，足以看出各种考核带给大家的压力呀。想发生信分析文章，从疾病入手是不二选择，双疾病甚至多疾病交叉、治疗靶点的预测、发病机制的挖掘，配上像机器学习和孟德尔随机化这样的手段，SCI简直手到擒来呀~~~

有老铁不信，咱就文献说话。今天的文献同样是国人团队发表的，用铜死亡相关基因撬开COVID-19和弥漫性大B细胞淋巴瘤的关系网，人人可复现的7.2分文章，套路学会批量完成也不难。那先来预览一下行文要点吧：

1.通过机器学习和单变量分析发现DLD是COVID-19患者和DLBCL患者共有的关键上调基因。再GEPIA和TISCH数据库中也验证了DLD在外周血和免疫细胞中的表达上调。

2.借助GSEA和GeneMANIA构建的PPI网络，挖出DLD参与的信号通路。同时TIMER也检测到DLD基因与免疫细胞浸润及免疫特征基因的关系。    

3.使用Cytoscape软件中的MCODE插件证明KDM1A与DLD正相关的表达关系，湿实验部分采用siRNA干扰DLD表达构建细胞模型，同时证明DLD表达被干扰对细胞周期和细胞凋亡的影响。

大家看看难度几何呀！光宝觉得这已经是对有生信发文需求的我们已经是很友好的了呀！对数据挖掘和机器学习感兴趣但技术受限的，或是对生信分析方向迷茫的宝子们，快来扫码联系光宝扫除障碍吧！~

研究背景

新型冠状病毒可引起或加重具有多种临床表现的癌症疾病。其他类型的癌症患者相比，感染了SARS-CoV-2的DLBCL患者死亡率更高。铜死亡cuprotosis相关基因(CRGs)已被证明是癌症的潜在治疗靶点，但CRGs在弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL患者感染COVID-19中的分子机制尚未报道。研究结果表明，CRGs在COVID-19的发生发展中发挥了重要作用。

数据来源

数据集/队列

数据库

数据类型

详细信息

GSE177477

GEO

基因芯片数据

29份SARS CoV-2阳性病例样本和18份COVID-19患者呼吸道样本的健康对照样本

GSE56315

GEO

基因芯片数据

包括33个匹配的正常样本和55个DLBCL样本

GSE25638

GEO

基因芯片数据

包括13个匹配的正常样本和26个DLBCL样本

GSE83632

GEO

基因芯片数据

包括来自87名健康献血者和76名DLBCL患者的外周血样本

TCGA-DLBC

GEO

基因芯片数据

包括33个DLBCL样本

GTEx

基因型-组织表达数据

337组正常样本

GSE175510

GEO

scRNA-seq

7例CNSL-DLBCL患者的CSF-DLBCs转录组测序

研究思路

作者的研究目的首先是阐明CRGs在COVID-19中的机制和作用。其次通过单因素和多因素分析以及机器学习筛选COVID-19和DLBCL中共同表达差异的CRGs。最后，通过细胞实验和免疫分析证实基因在DLBCL中的功能作用和免疫机制。

主要结果

1.  GEO数据库和机器学习用于筛选COVID-19关键CRGs

对GSE177477数据集进行基因表达分析，认为13个铜死亡相关基因CRGs具有显著差异(图1A-B)，13 CRGs主要在铜离子的作用下富集(图1C)。利用RF模型进一步筛选出SLC31A1、SLC31A2、MT4、SNCA、UBE2D4和DLD是对分类贡献最大的基因(图1D)，这6个基因可能是COVID-19的潜在生物标志物。

图1  GSE177477和机器学习用于筛选COVID-19关键CRGs

2.  DLD是DLBCL组织、外周血和scRNA-seq的潜在生物标志物

使用GSE177477数据集的COVID-19样本和GSE56315数据集的DLBCL样本。通过单变量分析和机器学习发现DLD是两种疾病之间存在显著差异的关键上调基因(图2A)。其次用GSE25638和在线数据库GEPIA(http://gepia.cancerpku.cn/)验证DLD在DLBCL中的基因表达水平，与正常DLBCL组织相比，DLD在癌组织中表达上调(图2B-C)。进一步分析外周血样本GSE83632数据集，发现DLD在DLBCL的外周血样本中显著上调(图2D)。基于肿瘤免疫单细胞中心TISCH数据库(http://tisch.comp-genomics.org/)，对独立的DLBCL数据集进行单细胞测序，探讨DLD表达水平与免疫细胞分布的相关性。在所有四种细胞中均发现高水平的DLD表达，特别是在CD8T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞和恶性细胞中(图2E)。

图2  DLD是DLBCL组织、外周血和scRNA-seq的潜在生物标志物

3.  DLD转录水平的途径富集分析和蛋白水平的机制分析

GSEA结果显示，高DLD主要富集类风湿关节炎、炎症性肠病、TNF信号通路(图3A)。使用GeneMANIA构建以DLD为中心的21个基因的PPI网络(图3B)再进行GO功能富集分析，富集的GO通路包括三羧酸循环、线粒体基质、三羧酸循环酶复合物(图3C)，提示DLD可能通过能量途径和炎症信号途径参与DLBCL的免疫炎症。

图3  DLD转录水平的途径富集分析和蛋白水平的机制分析

4.  DLD与免疫细胞浸润、免疫检查点及免疫特征基因的相关性分析

采用TIMER检测方法，发现DLD与免疫T细胞CD8浸润呈显著负相关(图4A)。Spearman相关分析结果显示，DLD与LAG3、免疫检查点CD276呈显著正相关(图4B)，与B细胞免疫显著特征基因、TAM免疫特征基因、树突状细胞免疫特征基因相关(图4C)。LAG3已被证明在活化的CD4+细胞和CD8+T细胞中表达。  

图4  DLD与免疫细胞浸润、免疫检查点及免疫特征基因的相关性分析

5.  KDM1A在DLBCL中的功能分析及DLD与KDM1A的相关性分析

KDM1A在DLBCL样本中显著表达(图5A)。红色代表疾病组，黑色代表健康组。通过GSE56315对TCGA数据排序的DLBCL中表达上调的基因进行分析并验证，共验证了124个差异基因(图5B)，通过Cytoscape软件中的MCODE插件获得关键功能基因模块。选取总分最高的共16个关键MCODE基因，spearman相关分析显示其中14个基因与KDM1A呈正相关(图5C)。富集分析结果显示，14个基因主要富集在细胞周期途径中，表明KDM1A主要调节DLBCL细胞的细胞周期（图5D）。最后，Spearman相关分析显示DLD表达与KDM1A表达显著正相关。

图5  KDM1A在DLBCL中的功能分析及DLD与KDM1A的相关性分析

6.  构建DLD干扰细胞模型，qPCR检测OCILY1细胞中KDM1A表达水平，建立DLD干扰细胞模型及细胞周期、凋亡实验

qPCR结果显示，转染OCI-LY1+DLD-siRNA1的细胞对DLD的干扰效果最显著(图6A)。因此将转染OCI-LY1+DLDsiRNA1的细胞作为DLD干扰的细胞模型，命名为OCI-LY1+DLD- siRNA1(590)。qPCR结果显示，KDM1A基因在OClLY1+DLD siRNA1(590)中呈现明显的下降趋势(图6B)。

细胞增殖结果显示，OCI-LY2+DLD-siRNA1（590）组G1期细胞显著增加，S期细胞显著减少，G2期细胞显著降低（图7A，B）。DLD的低表达明显抑制了DLBCL细胞周期的进展。

细胞凋亡结果显示，OCI-LY1+DLD- siRNA1(590)组细胞的凋亡率明显升高(图8A, B)。DLD的低表达显著促进了DLBCL细胞的凋亡。

图6  构建DLD干扰细胞模型，qPCR检测OCI-LY1细胞中KDM1A表达水平及DLD干扰细胞模型

图7  DLBCL细胞周期实验    

图8  DLBCL细胞凋亡实验

文章小结

干货看完收获满满吧！换药不换汤，到了年底不就能收获一沓文章接受信了嘛！想尝试文中出现的分析工具或其他线上资源？非肿瘤研究还有什么方向能满足你的文章需求？这些疑惑统统交给光宝帮你解决吧！

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