基因表达差异分析技术_RNAseq差异表达基因分析实战

DESeq2是一种常用的差异表达基因分析工具，可用于RNA-seq数据的差异表达分析。下面是DESeq2的详细使用步骤和全部脚本示例。

文章参考

Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2 | Genome Biology | Full Text (biomedcentral.com)

bioconda源对工具包的介绍：

Bioconductor – DESeq2

安装

下面是在R中安装DESeq2的详细步骤：

1. 安装R和RStudio：

   • 如果你还没有安装R，可以在R官方网站下载并安装最新版本的R。
   • 推荐使用RStudio作为R语言的集成开发环境。你可以在RStudio官网下载并安装适合你操作系统的版本。

2. 启动R或RStudio：

   • 打开R或者RStudio。

3. 安装DESeq2包：

   • 在R或RStudio的命令行中输入以下命令安装DESeq2包：

   if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager") BiocManager::install("DESeq2") 

   这将会从Bioconductor仓库安装DESeq2包及其依赖项。

4. 加载DESeq2包：

   • 安装完成后，在R或RStudio中输入以下命令加载DESeq2包：

   library(DESeq2)

   确保没有报错，这样DESeq2包就已经成功加载了。

安装完成后，你就可以使用DESeq2进行基因表达差异分析了。记得在分析之前准备好你的RNA-seq数据并按照DESeq2的文档或教程进行分析。

DESeq2 的完整使用步骤和示例分析脚本，以及每个步骤的输入、输出和解释。

步骤 1: 读取和整理数据

首先，加载必要的 R 包和数据文件。数据应该包括表达矩阵和样本信息。

# 读取 DESeq2 包 library(DESeq2) # 读取表达矩阵 countData <- as.matrix(read.csv("count_matrix.csv", row.names = 1)) # 读取样本信息 sampleInfo <- read.csv("sample_info.csv") # 创建 DESeq2 数据对象 dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData = sampleInfo, design = ~ condition) 

• count_matrix.csv: 包含基因或转录本的表达矩阵，行代表基因或转录本，列代表样本。
• sample_info.csv: 包含每个样本的信息，例如条件、分组等。

步骤 2: 数据标准化和差异表达分析

使用 DESeq2 对数据进行标准化和差异表达分析。

# 标准化数据 dds <- DESeq(dds) # 进行差异表达分析 res <- results(dds) 

步骤 3: 结果解释和可视化

对差异表达结果进行解释和可视化。

# 查看差异表达基因 topGenes <- head(rownames(res[order(res$padj), ]), 10) # 输出差异表达基因 write.csv(res, file = "deseq2_results.csv") # 绘制差异表达图 plotCounts(dds, gene = topGenes, intgroup = "condition") 

• deseq2_results.csv: 包含差异表达分析结果的输出文件。

解释和注意事项：

• DESeqDataSetFromMatrix(): 用于创建 DESeq2 数据对象，其中 countData 是表达矩阵，sampleInfo 包含样本信息，design 参数指定实验设计。
• DESeq(): 对数据进行归一化和标准化，准备进行差异表达分析。
• results(): 提取差异表达分析的结果，包括基因表达差异统计信息。
• 结果包括基因表达水平的差异统计指标，如 fold change、调整的 p 值（padj）等。
• plotCounts(): 用于绘制基因表达水平的差异示意图，以更直观地展示不同条件下基因的表达情况。

使用案例

以下是三个使用 DESeq2 工具包的案例，包括完整的脚本以及输入输出文件内容和格式的详细解释。

案例 1: 基因差异表达分析

输入文件:

• count_matrix.csv: 包含基因表达计数矩阵，行代表基因，列代表样本。
• sample_info.csv: 包含每个样本的信息，例如条件或组别。

脚本:

# 读取 DESeq2 包 library(DESeq2) # 读取表达矩阵和样本信息 countData <- as.matrix(read.csv("count_matrix.csv", row.names = 1)) sampleInfo <- read.csv("sample_info.csv") # 创建 DESeq2 数据对象 dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData = sampleInfo, design = ~ condition) # 标准化数据和进行差异表达分析 dds <- DESeq(dds) res <- results(dds) # 输出差异表达基因列表和统计信息 write.csv(res, file = "deseq2_results.csv") # 绘制差异表达基因的表达图 topGenes <- head(rownames(res[order(res$padj), ]), 10) plotCounts(dds, gene = topGenes, intgroup = "condition") 

输出文件:

• deseq2_results.csv: 包含差异表达分析结果的输出文件。包括基因、fold change、p 值、调整的 p 值等信息。
• 图形文件：包含差异表达基因的表达图，显示不同条件下基因的表达情况。

案例 2: 多组实验设计的差异分析

输入文件:

• count_matrix.csv
• sample_info_multigroup.csv: 包含多组实验设计的样本信息。

脚本:

# 读取 DESeq2 包 library(DESeq2) # 读取表达矩阵和样本信息 countData <- as.matrix(read.csv("count_matrix.csv", row.names = 1)) sampleInfo <- read.csv("sample_info_multigroup.csv") # 创建 DESeq2 数据对象（多组实验设计） dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData = sampleInfo, design = ~ group + condition) # 标准化数据和进行差异表达分析 dds <- DESeq(dds) res <- results(dds) # 输出差异表达基因列表和统计信息 write.csv(res, file = "deseq2_results_multigroup.csv") 

输出文件:

• deseq2_results_multigroup.csv: 包含多组实验设计差异表达分析结果的输出文件。

• gene_id: 基因或转录本的标识符。
• baseMean: 平均表达量。
• log2FoldChange: 对数变换后的 fold change，表示在不同条件之间的表达倍数变化。
• lfcSE: log2 fold change 的标准误差。
• stat: 统计检验值。
• pvalue: 未经校正的 p 值。
• padj: 经过多重假设检验校正后的调整 p 值（通常使用 FDR 校正），用于控制假阳性发现率。

案例 3: 时间序列分析

输入文件:

• count_matrix_timeseries.csv: 包含时间序列实验的基因表达计数矩阵。

• sample_info_timeseries.csv: 包含时间序列实验的样本信息，包括时间点等信息。

脚本:

# 读取 DESeq2 包 library(DESeq2) # 读取表达矩阵和样本信息 countData <- as.matrix(read.csv("count_matrix_timeseries.csv", row.names = 1)) sampleInfo <- read.csv("sample_info_timeseries.csv") # 创建 DESeq2 数据对象（时间序列实验设计） dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData = sampleInfo, design = ~ time_point) # 标准化数据和进行差异表达分析 dds <- DESeq(dds) res <- results(dds) # 输出差异表达基因列表和统计信息 write.csv(res, file = "deseq2_results_timeseries.csv") 

输出文件:

• deseq2_results_timeseries.csv: 包含时间序列实验差异表达分析结果的输出文件。

 DESeq2分析结果进行差异表达火山图的绘制

DESeq2 的结果文件 deseq2_results.csv，文件的格式类似于：

使用 R 语言和 ggplot2 库来绘制火山图的示例代码：

# 导入必要的库 library(ggplot2) library(dplyr) # 用于数据处理 # 读取差异表达结果文件 results <- read.csv("deseq2_results.csv") # 设定显著性阈值（例如，调整的 p 值） threshold <- 0.05 # 根据显著性阈值筛选差异表达基因 significant_genes <- results %>% filter(padj < threshold) # 绘制火山图 ggplot(results, aes(x = log2FoldChange, y = -log10(padj), color = ifelse(padj < threshold, "red", "black"))) + geom_point(size = 1.5) + scale_color_manual(values = c("black", "red"), labels = c("Not significant", "Significant")) + labs(x = "log2(Fold Change)", y = "-log10(adjusted p-value)", title = "Volcano Plot of Differential Expression") + theme_minimal() 

这段代码将根据调整的 p 值（padj）和 fold change（log2FoldChange）绘制火山图。显著性基因将以红色标记，非显著性基因将以黑色标记。您可以调整 threshold 的值来控制显著性。

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