primer 5.0如何设计引物_pcr引物设计详细步骤

PCR引物设计应该算是生物实验基本技能吧，工具也非常多。Primer-BLAST、Primer Premier 都是比较经典的软件，除此之外还有很多新的在线设计软件，也很方便。不过今天不是要讲怎么用这些现成软件来设计引物，而是要讲讲怎么用Python来做引物设计。

Primer3-py 是 Primer3 在 Python 中的一个“包装”，用 Primer3-py 官方的说法就是：提供一个简单可靠的方式让你能更好的自动化设计引物 (The intention is to provide a simple and reliable interface for automated oligo analysis and design)。

注：有人可能没怎么听过 Primer3，这是个引物设计的程序，NCBI 的 Primer-BLAST 引物设计部分用的就是 Primer3。除此之外，Primer3 还有几个网页版和命令行版本，引用次数非常高，高到你难以想象 … 可以检索一下 Primer3 on the WWW for General Users And For Biologist Programmers

安装

有两种方法，都非常方便：

方法一，使用 pip：

pip install Cython

pip install primer3-py

方法二，使用 Bioconda：

conda install -c bioconda primer3-py

安装好 Primer3-py 之后，不需要另外再单独安装 Primer3。

注：我个人推荐使用 Bioconda 来安装生物及编程相关的各种软件和包，非常出色的一个管理器，虽然有些小瑕疵，但瑕不掩瑜，对做生信分析的人来说算得上是福音，特别是在你被各种软件各种包的安装问题折磨千百遍之后。(这里特指在 Linux 下，其他类型的系统上没有用过，就不评价了)

功能

Primer3-py 的功能其实分两部分：一部分是其本身自带的 引物“热力学计算” 功能，另一部分就是 调用 Primer3 进行引物设计 的功能。

后文用做示例的模板序列来自于部分 BRCA2 的 DNA 序列，FASTA 序列如下：

>NC_000013.11:32315480-32399672 Homo sapiens chromosome 13, GRCh38.p12 Primary Assembly

GTGGCGCGAGCTTCTGAAACTAGGCGGCAGAGGCGGAGCCGCTGTGGCACTGCTGCGCCTCTGCTGCGCC

TCGGGTGTCTTTTGCGGCGGTGGGTCGCCGCCGGGAGAAGCGTGAGGGGACAGATTTGTGACCGGCGCGG

TTTTTGTCAGCTTACTCCGGCCAAAAAAGAACTGCACCTCTGGAGCGGGTTAGTGGTGGTGGTAGTGGGT

Primer3-py 自带功能：引物热力学参数评估

主要有5个可用的命令，分别评估几个引物的热力学参数：

热力学参数

Primer3-py 命令

Tm值

calcTm()

发夹结构

calcHairpin()

同源二聚体

calcHomodimer()

异质二聚体

calcHeterodimer()

3’端稳定性

calcEndStability()

具体例子：

FASTA = “””>NC_000013.11:32315480-32399672 Homo sapiens chromosome 13, GRCh38.p12 Primary Assembly

GTGGCGCGAGCTTCTGAAACTAGGCGGCAGAGGCGGAGCCGCTGTGGCACTGCTGCGCCTCTGCTGCGCC

TCGGGTGTCTTTTGCGGCGGTGGGTCGCCGCCGGGAGAAGCGTGAGGGGACAGATTTGTGACCGGCGCGG

TTTTTGTCAGCTTACTCCGGCCAAAAAAGAACTGCACCTCTGGAGCGGGTTAGTGGTGGTGGTAGTGGGT

“””

# 计算引物 Tm 值

primer3.calcTm(“GTGGCGCGAGCTTCTGAAAC”)

“”” 结 果 >>> 56.89119991230376 “””

# 检查引物中是否有 发夹结构

primer3.calcHairpin(“GTGGCGCGAGCTTCTGAAAC”)

“”” 结 果 >>> ThermoResult(structure_found=True, tm=57.92, dg=-1484.80, dh=-23500.00, ds=-70.98)”””

# 计算引物 同源二聚体

primer3.calcHomodimer(“GTGGCGCGAGCTTCTGAAAC”)

“”” 结 果 >>> ThermoResult(structure_found=True, tm=9.76, dg=-6863.20, dh=-45200.00, ds=-123.61) “””

# 计算引物 异质二聚体

primer3.calcHeterodimer(“GTGGCGCGAGCTTCTGAAAC”, FASTA)

“”” 结 果 >>> ThermoResult(structure_found=True, tm=21.59, dg=-6561.64, dh=-89000.00, ds=-265.80) “””

# 计算引物 3’端稳定性

primer3.bindings.calcEndStability(“GTGGCGCGAGCTTCTGAAAC”, FASTA)

“”” 结 果 >>> ThermoResult(structure_found=True, tm=15.21, dg=-3968.79, dh=-95900.00, ds=-296.41) “””

通过 Primer3-py 调用 Primer3：设计引物

用 Primer3-py 来调用 Primer3 可以说是非常方便了，一行代码的事：

primer3.bindings.designPrimers()

不过这行命令的主要参数有两个：seq_args(Primer3 序列和设计参数)和 global_args(Primer3 全局参数)

而这两个参数包含了 Primer3 里的参数，那么麻烦就来了。因为 Primer3 需要读取一个配置文件(Setting File)，包含用于引物设计所有参数，而包括序列本身在内，Primer3 配置文件中可选的参数大概有100～200个，版本不同参数还会有些出入( Primer3-py 内置的是 v2.3.7 )。因为参数实在是太多，具体的使用和解释要参考 Primer3 的官方文档：http://primer3.sourceforge.net/primer3_manual.htm

在这里就先不一一细说了，修改了 Primer3-py 文档示例参数用来演示， 在下一篇文章里会挑重点和结果一起分析。

# Primer3 序列和设计参数，必须要有

seq_args = {

‘SEQUENCE_ID’: ‘BRCA2_SEGMENT’,

‘SEQUENCE_TEMPLATE’: “GTGGCGCGAGCTTCTGAAACTAGGCGGCAGAGGCGGAGCCGCTGTGGCACTGCTGCGCCTCTGCTGCGCCTCGGGTGTCTTTTGCGGCGGTGGGTCGCCGCCGGGAGAAGCGTGAGGGGACAGATTTGTGACCGGCGCGGTTTTTGTCAGCTTACTCCGGCCAAAAAAGAACTGCACCTCTGGAGCGGGTTAGTGGTGGTGGTAGTGGGT”,

‘SEQUENCE_INCLUDED_REGION’: [0,210],

}

# Primer3 全局参数，这个可选

global_args = {

‘PRIMER_OPT_SIZE’: 20,

‘PRIMER_PICK_INTERNAL_OLIGO’: 1,

‘PRIMER_INTERNAL_MAX_SELF_END’: 8,

‘PRIMER_MIN_SIZE’: 18,

‘PRIMER_MAX_SIZE’: 25,

‘PRIMER_OPT_TM’: 60.0,

‘PRIMER_MIN_TM’: 57.0,

‘PRIMER_MAX_TM’: 63.0,

‘PRIMER_MIN_GC’: 20.0,

‘PRIMER_MAX_GC’: 80.0,

‘PRIMER_MAX_POLY_X’: 100,

‘PRIMER_INTERNAL_MAX_POLY_X’: 100,

‘PRIMER_SALT_MONOVALENT’: 50.0,

‘PRIMER_DNA_CONC’: 50.0,

‘PRIMER_MAX_NS_ACCEPTED’: 0,

‘PRIMER_MAX_SELF_ANY’: 12,

‘PRIMER_MAX_SELF_END’: 8,

‘PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_ANY’: 12,

‘PRIMER_PAIR_MAX_COMPL_END’: 8,

‘PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE’: [[75,100],[100,125],[125,150],[150,175],[175,200]],

}

# 执行命令并返回结果

primer3_result = primer3.bindings.designPrimers(seq_args, global_args)

# 或者不使用 Primer3

primer3_primary_result = primer3.bindings.designPrimers(seq_args)

返回的结果是一个Python字典，内容非常多，乍一看毫无头绪，不过处理一下就会清晰很多。

{‘PRIMER_LEFT_EXPLAIN’: ‘considered 1088, GC content failed 57, low tm 31, high tm 833, ok 167’,

‘PRIMER_RIGHT_EXPLAIN’: ‘considered 1088, GC content failed 47, low tm 93, high tm 644, ok 304’,

‘PRIMER_INTERNAL_EXPLAIN’: ‘considered 1885, GC content failed 67, low tm 453, high tm 661, ok 704’,

‘PRIMER_PAIR_EXPLAIN’: ‘considered 186, unacceptable product size 181, ok 5’,

‘PRIMER_LEFT_NUM_RETURNED’: 5,

‘PRIMER_RIGHT_NUM_RETURNED’: 5,

‘PRIMER_INTERNAL_NUM_RETURNED’: 5,

‘PRIMER_PAIR_NUM_RETURNED’: 5,

‘PRIMER_PAIR_0_PENALTY’: 0.07203216442314897,

‘PRIMER_LEFT_0_PENALTY’: 0.0360099993838503,

‘PRIMER_RIGHT_0_PENALTY’: 0.03602216503929867,

‘PRIMER_INTERNAL_0_PENALTY’: 0.04672637428285498,

‘PRIMER_LEFT_0_SEQUENCE’: ‘AGCGTGAGGGGACAGATTTG’,

‘PRIMER_RIGHT_0_SEQUENCE’: ‘GCTCCAGAGGTGCAGTTCTT’,

‘PRIMER_INTERNAL_0_SEQUENCE’: ‘CCGGCGCGGTTTTTGTCAGC’,

‘PRIMER_LEFT_0’: (108, 20),

‘PRIMER_RIGHT_0’: (185, 20),

‘PRIMER_INTERNAL_0’: (131, 20),

‘PRIMER_LEFT_0_TM’: 60.03600999938385,

‘PRIMER_RIGHT_0_TM’: 59.9639778349607,

‘PRIMER_INTERNAL_0_TM’: 60.046726374282855,

‘PRIMER_LEFT_0_GC_PERCENT’: 55.0,

‘PRIMER_RIGHT_0_GC_PERCENT’: 55.0,

‘PRIMER_INTERNAL_0_GC_PERCENT’: 65.0,

‘PRIMER_LEFT_0_SELF_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_0_SELF_ANY_TH’: 5.308994554799938,

‘PRIMER_INTERNAL_0_SELF_ANY_TH’: 6.715563508517448,

‘PRIMER_LEFT_0_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_0_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_INTERNAL_0_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_LEFT_0_HAIRPIN_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_0_HAIRPIN_TH’: 41.267496973905224,

‘PRIMER_INTERNAL_0_HAIRPIN_TH’: 38.99011028469272,

‘PRIMER_LEFT_0_END_STABILITY’: 2.32,

‘PRIMER_RIGHT_0_END_STABILITY’: 2.52,

‘PRIMER_PAIR_0_COMPL_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_PAIR_0_COMPL_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_PAIR_0_PRODUCT_SIZE’: 78,

‘PRIMER_PAIR_1_PENALTY’: 0.2323444485285222,

‘PRIMER_LEFT_1_PENALTY’: 0.04078105057766379,

‘PRIMER_RIGHT_1_PENALTY’: 0.19156339795085842,

‘PRIMER_INTERNAL_1_PENALTY’: 0.1759585850769554,

‘PRIMER_LEFT_1_SEQUENCE’: ‘GCGCGGTTTTTGTCAGCTTA’,

‘PRIMER_RIGHT_1_SEQUENCE’: ‘ACCCACTACCACCACCACTA’,

‘PRIMER_INTERNAL_1_SEQUENCE’: ‘ACTGCACCTCTGGAGCGGGT’,

‘PRIMER_LEFT_1’: (134, 20),

‘PRIMER_RIGHT_1’: (209, 20),

‘PRIMER_INTERNAL_1’: (170, 20),

‘PRIMER_LEFT_1_TM’: 60.040781050577664,

‘PRIMER_RIGHT_1_TM’: 59.80843660204914,

‘PRIMER_INTERNAL_1_TM’: 59.824041414923045,

‘PRIMER_LEFT_1_GC_PERCENT’: 50.0,

‘PRIMER_RIGHT_1_GC_PERCENT’: 55.0,

‘PRIMER_INTERNAL_1_GC_PERCENT’: 65.0,

‘PRIMER_LEFT_1_SELF_ANY_TH’: 8.834562170276627,

‘PRIMER_RIGHT_1_SELF_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_INTERNAL_1_SELF_ANY_TH’: 13.054545961563008,

‘PRIMER_LEFT_1_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_1_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_INTERNAL_1_SELF_END_TH’: 4.711373579171379,

‘PRIMER_LEFT_1_HAIRPIN_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_1_HAIRPIN_TH’: 0.0,

‘PRIMER_INTERNAL_1_HAIRPIN_TH’: 41.81896803359854,

‘PRIMER_LEFT_1_END_STABILITY’: 3.09,

‘PRIMER_RIGHT_1_END_STABILITY’: 2.74,

‘PRIMER_PAIR_1_COMPL_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_PAIR_1_COMPL_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_PAIR_1_PRODUCT_SIZE’: 76,

‘PRIMER_PAIR_2_PENALTY’: 0.2842985295354765,

‘PRIMER_LEFT_2_PENALTY’: 0.0360099993838503,

‘PRIMER_RIGHT_2_PENALTY’: 0.24828853015162622,

‘PRIMER_INTERNAL_2_PENALTY’: 0.04672637428285498,

‘PRIMER_LEFT_2_SEQUENCE’: ‘AGCGTGAGGGGACAGATTTG’,

‘PRIMER_RIGHT_2_SEQUENCE’: ‘CTACCACCACCACTAACCCG’,

‘PRIMER_INTERNAL_2_SEQUENCE’: ‘CCGGCGCGGTTTTTGTCAGC’,

‘PRIMER_LEFT_2’: (108, 20),

‘PRIMER_RIGHT_2’: (204, 20),

‘PRIMER_INTERNAL_2’: (131, 20),

‘PRIMER_LEFT_2_TM’: 60.03600999938385,

‘PRIMER_RIGHT_2_TM’: 59.751711469848374,

‘PRIMER_INTERNAL_2_TM’: 60.046726374282855,

‘PRIMER_LEFT_2_GC_PERCENT’: 55.0,

‘PRIMER_RIGHT_2_GC_PERCENT’: 60.0,

‘PRIMER_INTERNAL_2_GC_PERCENT’: 65.0,

‘PRIMER_LEFT_2_SELF_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_2_SELF_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_INTERNAL_2_SELF_ANY_TH’: 6.715563508517448,

‘PRIMER_LEFT_2_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_2_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_INTERNAL_2_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_LEFT_2_HAIRPIN_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_2_HAIRPIN_TH’: 0.0,

‘PRIMER_INTERNAL_2_HAIRPIN_TH’: 38.99011028469272,

‘PRIMER_LEFT_2_END_STABILITY’: 2.32,

‘PRIMER_RIGHT_2_END_STABILITY’: 5.28,

‘PRIMER_PAIR_2_COMPL_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_PAIR_2_COMPL_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_PAIR_2_PRODUCT_SIZE’: 97,

‘PRIMER_PAIR_3_PENALTY’: 0.28653552146357697,

‘PRIMER_LEFT_3_PENALTY’: 0.2505133564242783,

‘PRIMER_RIGHT_3_PENALTY’: 0.03602216503929867,

‘PRIMER_INTERNAL_3_PENALTY’: 0.04672637428285498,

‘PRIMER_LEFT_3_SEQUENCE’: ‘GAAGCGTGAGGGGACAGATT’,

‘PRIMER_RIGHT_3_SEQUENCE’: ‘GCTCCAGAGGTGCAGTTCTT’,

‘PRIMER_INTERNAL_3_SEQUENCE’: ‘CCGGCGCGGTTTTTGTCAGC’,

‘PRIMER_LEFT_3’: (106, 20),

‘PRIMER_RIGHT_3’: (185, 20),

‘PRIMER_INTERNAL_3’: (131, 20),

‘PRIMER_LEFT_3_TM’: 59.74948664357572,

‘PRIMER_RIGHT_3_TM’: 59.9639778349607,

‘PRIMER_INTERNAL_3_TM’: 60.046726374282855,

‘PRIMER_LEFT_3_GC_PERCENT’: 55.0,

‘PRIMER_RIGHT_3_GC_PERCENT’: 55.0,

‘PRIMER_INTERNAL_3_GC_PERCENT’: 65.0,

‘PRIMER_LEFT_3_SELF_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_3_SELF_ANY_TH’: 5.308994554799938,

‘PRIMER_INTERNAL_3_SELF_ANY_TH’: 6.715563508517448,

‘PRIMER_LEFT_3_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_3_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_INTERNAL_3_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_LEFT_3_HAIRPIN_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_3_HAIRPIN_TH’: 41.267496973905224,

‘PRIMER_INTERNAL_3_HAIRPIN_TH’: 38.99011028469272,

‘PRIMER_LEFT_3_END_STABILITY’: 2.4,

‘PRIMER_RIGHT_3_END_STABILITY’: 2.52,

‘PRIMER_PAIR_3_COMPL_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_PAIR_3_COMPL_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_PAIR_3_PRODUCT_SIZE’: 80,

‘PRIMER_PAIR_4_PENALTY’: 0.3576746687102741,

‘PRIMER_LEFT_4_PENALTY’: 0.3216525036709754,

‘PRIMER_RIGHT_4_PENALTY’: 0.03602216503929867,

‘PRIMER_INTERNAL_4_PENALTY’: 0.04672637428285498,

‘PRIMER_LEFT_4_SEQUENCE’: ‘GCGTGAGGGGACAGATTTGT’,

‘PRIMER_RIGHT_4_SEQUENCE’: ‘GCTCCAGAGGTGCAGTTCTT’,

‘PRIMER_INTERNAL_4_SEQUENCE’: ‘CCGGCGCGGTTTTTGTCAGC’,

‘PRIMER_LEFT_4’: (109, 20),

‘PRIMER_RIGHT_4’: (185, 20),

‘PRIMER_INTERNAL_4’: (131, 20),

‘PRIMER_LEFT_4_TM’: 60.321652503670975,

‘PRIMER_RIGHT_4_TM’: 59.9639778349607,

‘PRIMER_INTERNAL_4_TM’: 60.046726374282855,

‘PRIMER_LEFT_4_GC_PERCENT’: 55.0,

‘PRIMER_RIGHT_4_GC_PERCENT’: 55.0,

‘PRIMER_INTERNAL_4_GC_PERCENT’: 65.0,

‘PRIMER_LEFT_4_SELF_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_4_SELF_ANY_TH’: 5.308994554799938,

‘PRIMER_INTERNAL_4_SELF_ANY_TH’: 6.715563508517448,

‘PRIMER_LEFT_4_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_RIGHT_4_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_INTERNAL_4_SELF_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_LEFT_4_HAIRPIN_TH’: 41.18192535348908,

‘PRIMER_RIGHT_4_HAIRPIN_TH’: 41.267496973905224,

‘PRIMER_INTERNAL_4_HAIRPIN_TH’: 38.99011028469272,

‘PRIMER_LEFT_4_END_STABILITY’: 2.83,

‘PRIMER_RIGHT_4_END_STABILITY’: 2.52,

‘PRIMER_PAIR_4_COMPL_ANY_TH’: 0.0,

‘PRIMER_PAIR_4_COMPL_END_TH’: 0.0,

‘PRIMER_PAIR_4_PRODUCT_SIZE’: 77}

注：引物设计参数和结果的具体释义还是要回到 Primer3 文档中去找，下一篇会进一步介绍

Primer3 返回结果的处理

先看看处理完的效果：

PRIMER_PAIR_0

PRIMER_PAIR_1

PRIMER_PAIR_2

PRIMER_PAIR_3

PRIMER_PAIR_4

PRIMER_PAIR_PENALTY

0.0720322

0.232344

0.284299

0.286536

0.357675

PRIMER_LEFT_PENALTY

0.03601

0.0407811

0.03601

0.250513

0.321653

PRIMER_RIGHT_PENALTY

0.0360222

0.191563

0.248289

0.0360222

0.0360222

PRIMER_INTERNAL_PENALTY

0.0467264

0.175959

0.0467264

0.0467264

0.0467264

PRIMER_LEFT_SEQUENCE

AGCGTGAGGGGACAGATTTG

GCGCGGTTTTTGTCAGCTTA

AGCGTGAGGGGACAGATTTG

GAAGCGTGAGGGGACAGATT

GCGTGAGGGGACAGATTTGT

PRIMER_RIGHT_SEQUENCE

GCTCCAGAGGTGCAGTTCTT

ACCCACTACCACCACCACTA

CTACCACCACCACTAACCCG

GCTCCAGAGGTGCAGTTCTT

GCTCCAGAGGTGCAGTTCTT

PRIMER_INTERNAL_SEQUENCE

CCGGCGCGGTTTTTGTCAGC

ACTGCACCTCTGGAGCGGGT

CCGGCGCGGTTTTTGTCAGC

CCGGCGCGGTTTTTGTCAGC

CCGGCGCGGTTTTTGTCAGC

PRIMER_LEFT

(108, 20)

(134, 20)

(108, 20)

(106, 20)

(109, 20)

PRIMER_RIGHT

(185, 20)

(209, 20)

(204, 20)

(185, 20)

(185, 20)

PRIMER_INTERNAL

(131, 20)

(170, 20)

(131, 20)

(131, 20)

(131, 20)

PRIMER_LEFT_TM

60.036

60.0408

60.036

59.7495

60.3217

PRIMER_RIGHT_TM

59.964

59.8084

59.7517

59.964

59.964

PRIMER_INTERNAL_TM

60.0467

59.824

60.0467

60.0467

60.0467

PRIMER_LEFT_GC_PERCENT

55

50

55

55

55

PRIMER_RIGHT_GC_PERCENT

55

55

60

55

55

PRIMER_INTERNAL_GC_PERCENT

65

65

65

65

65

PRIMER_LEFT_SELF_ANY_TH

0

8.83456

0

0

0

PRIMER_RIGHT_SELF_ANY_TH

5.30899

0

0

5.30899

5.30899

PRIMER_INTERNAL_SELF_ANY_TH

6.71556

13.0545

6.71556

6.71556

6.71556

PRIMER_LEFT_SELF_END_TH

0

0

0

0

0

PRIMER_RIGHT_SELF_END_TH

0

0

0

0

0

PRIMER_INTERNAL_SELF_END_TH

0

4.71137

0

0

0

PRIMER_LEFT_HAIRPIN_TH

0

0

0

0

41.1819

PRIMER_RIGHT_HAIRPIN_TH

41.2675

0

0

41.2675

41.2675

PRIMER_INTERNAL_HAIRPIN_TH

38.9901

41.819

38.9901

38.9901

38.9901

PRIMER_LEFT_END_STABILITY

2.32

3.09

2.32

2.4

2.83

PRIMER_RIGHT_END_STABILITY

2.52

2.74

5.28

2.52

2.52

PRIMER_PAIR_COMPL_ANY_TH

0

0

0

0

0

PRIMER_PAIR_COMPL_END_TH

0

0

0

0

0

PRIMER_PAIR_PRODUCT_SIZE

78

76

97

80

77

通过处理之后，将看起来没有头绪的“字典”处理成了比较易读的“数据框” ( Dataframe )，这是一种在 R 语言里非常基础的数据格式，最大的优点就是直观，Excel 的表格也长类似的样子。在处理结果的过程当中使用了另外一个强大的 Python 包：Pandas

注：最初开发 Pandas 的目的就是为了将 R 语言的数据处理方式移植到 Python 里，后来随着 Python 被广泛应用于数据分析和人工智能，Pandas 成为了 Python 处理数据时不可或缺的工具包。

要处理 Primer3 返回的结果，第一反应肯定是回头再仔细观察一下 Primer3 返回的结果，看是不是有规律可循。果不其然，除了前几行是一些统计信息外，剩下都是引物对本身的信息，每对引物都有共同的信息，不同引物对间通过数字编号加以区分。另外从 ‘PRIMER_PAIR_NUM_RETURNED’: 5 这一行知道总共有5对引物。有规律可循，那接下来事情就好办了。

第一步：将结果转换成以“引物信息”为键值的新形式的“字典”：

primer3_result_table_dict = {}

for i in range(primer3_result[“PRIMER_PAIR_NUM_RETURNED”]):

primer_id = str(i)

for key in primer3_result:

if primer_id in key:

# 要将每个信息中的数字和下划线去掉

info_tag = key.replace(“_” + primer_id, “”)

# 就是把不同的引物对结果归到一起

try:

primer3_result_table_dict[info_tag]

except:

primer3_result_table_dict[info_tag] = []

finally:

primer3_result_table_dict[info_tag].append(primer3_result[key])

第二步：用 Pandas 将新“字典”转换成“数据框”：

import pandas as pd

index = []

for i in range(primer3_result[“PRIMER_PAIR_NUM_RETURNED”]):

# 为每一对引物加个索引

index.append(“PRIMER_PAIR_” + str(i))

# 一步完成 “字典” => “数据框”

primer3_result_df = pd.DataFrame(primer3_result_table_dict, index=index)

# 转置一下，更方便查看一些

primer3_result_df = primer3_result_df.T

# 导出成文件，可以用Excel或者其他编辑器打开查看

primer3_result_df.to_csv(“primer3_result.csv”, sep=”\t”)

print(primer3_result_df)

如果觉得看表格还是不够直观，那么通过可视化来变得更直观一些。用引物 TM 值的数据来做个例子：

TM 的折线图

这是用 Plotly 包做的可视化，因为与主题相关性不大就不放了代码了，除了 Plotly 之外优秀的 Python 可视化包还有很多。不过与其他包相比，Plotly 最大的优点是它的交互性非常好，如果有兴趣了解，之后会有可视化相关的文章进行详细介绍。

总结：

实话说，现在的引物设计软件已经非常方便了，很多人会觉得实在想不出来为什么还要多此一举，趟这个浑水自己写代码。如果你只是偶尔设计一两对引物，那么确实是完全没有必要。不过当需要设计高通量测序 Panel(什么是 Panel ？往期易微升文章有介绍)的时候，你可能要同时设计几十甚至上百对引物，完了之后还要通过参数进行微调，以减小每对引物之间的相互影响。这对于一般的设计软件是不是就成了几乎不可能完成的任务。而 Primer3-py 的优势在这里就体现出来了，不仅可以通过调用 Primer3 来进行细致和精准的引物设计和调整，还能便捷的衔接 Python 将引物设计的前后处理流程化，使批量引物设计变得更高效和可控。这些内容的细节，也是之后要介绍的“多重PCR引物设计”中的一部分，对于喜欢鼓捣的人来说，完成这个任务是个不错的挑战。随着“多重PCR捕获-高通量测序”不断被应用于各个场景，“多重PCR引物设计”的实用性也在随之增加。

文章中测试使用的环境：

Ubuntu： 18.04.1 LTS

Python： v3.6.7

Jupyterlab： v0.35.4

Primer3-py： v0.5.7

Pandas： v0.23.4

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