oxford imagine_maestro制谱软件

前言

随着三代纳米孔测序技术的不断发展，Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司在持续更新其测序试剂耗材(比如发布R10版本的Flow cell和Kit14系列测序试剂)的同时，也在同步更新其配套分析软件，如碱基识别软件Guppy/Dorado/Bonito、碱基修饰识别软件Remora、测序控制软件MinKNOW、一致性序列生成软件Medaka等。纳米孔测序技术虽然有着便捷、实时、读长长等特点，但其本身存在一定的测序错误。ONT官方已经发布了多个版本的Medaka，该工具基于修正序列(sequence correction)来生成一致性序列和鉴别突变。

一、Medaka是什么？

medaka is a tool to create consensus sequences and variant calls from nanopore sequencing data. This task is performed using neural networks applied a pileup of individual sequencing reads against a draft assembly. It provides state-of-the-art results outperforming sequence-graph based methods and signal-based methods, whilst also being faster.

这是ONT官方对Medaka的基本定义，目前已更新至1.7.3版本。该软件的更新几乎与ONT测序芯片和测序试剂的更新迭代同步。比如，ONT发布了最新的R10.4.1芯片和E8.2(Kit14系列)测序试剂不久，Medaka就随之更新，以支持上述最新测序试剂耗材产生的测序数据的分析。

该软件最大的特点就是分析速度快且无需读入原始测序电信号fast5文件。仅需fasta或fastq文件即可开始分析。与ONT早期突变识别工具Nanopolish相比，速度提升极大。

Features

Requires only basecalled data. (.fasta or .fastq)

Improved accuracy over graph-based methods (e.g. Racon).

50X faster than Nanopolish (and can run on GPUs).

Includes extras for implementing and training bespoke correction networks.

Works on Linux and MacOS.

Open source (Mozilla Public License 2.0).

二、使用步骤

1.安装

可参考其Github网页进行安装，地址为https://github.com/nanoporetech/medaka.

(1)conda安装

在Terminal中输入如下命令即可安装：

conda create -n medaka -c conda-forge -c bioconda medaka

(2)pip安装

另一种便捷的安装方式是使用pip。但要注意的是首先提前安装依赖的其他软件，包括：

samtools
minimap2
tabix
bgzip

然后再运行如下命令：

pip install medaka

其他安装方式可参考Github网页。

2.快速使用

(1)核心参数”-m”

Medaka基于序列修正来生成一致性序列和鉴别突变。前面提到，ONT的测序准确度虽然一直在提升，但其长读长序列仍存在一定错误，因此仍需进行校正操作以提升下游分析的准确性。不论是生成一致性序列还是鉴别突变，都需要向软件提供”-m”参数及具体模型。该参数与测序使用的碱基识别软件版本(一般是Guppy)、碱基识别模型(fast/hac/sup)、测序芯片(R9或R10)、测序试剂(Kit9、Kit10、Kit12或Kit14)和测序仪(MinION/GridION/PromethION)等密切相关。其基本模式为：

{pore}_{device}_{caller variant}_{caller version}

比如r941_min_fast_g303可以处理的数据应满足如下标准：在MinION或GridION测序仪上使用R9.4.1芯片上测序且用Guppy v3.0.3 快速碱基识别模型(fast)产生的测序数据。再比如，r941_prom_hac_g507可以处理的数据应满足如下标准：在PromethION测序仪上使用R9.4.1芯片上测序且用Guppy v5.0.7高准确度识别模型(high accurate)产生的测序数据。

可使用如下命令来查看Medaka支持的模型。当实际测序使用的Guppy版本与Medaka模型不一致时，选择的Medaka模型中的Guppy版本不得高于测序使用的Guppy版本。

medaka tools list_models

运行完上述命令以后可以得到如下模型列表，还会看到诸如r941_min_sup_variant_g507等包含variant关键词的模型，这些模型用于鉴别基因组突变。

(2)生成一致性序列

可使用medaka_consensus来生成一致性序列。基本输入包括拼接后的基因组草图，拼接时使用的fastq或fasta文件以及匹配的model文件，基本使用方法如下：

NPROC=$(nproc)
BASECALLS=basecalls.fa
DRAFT=draft_assm/assm_final.fa
OUTDIR=medaka_consensus
medaka_consensus -i ${BASECALLS} -d ${DRAFT} -o ${OUTDIR} -t ${NPROC} -m r941_min_high_g303

生成的一致性序列在-o指定的目录里。这里需要注意的是，基因组草图应使用拼接软件Flye(https://github.com/fenderglass/Flye)生成。

(3)鉴别单倍体突变

可使用medaka_haploid_variant来鉴别细菌或病毒基因组突变。基本输入包括参考序列、测序fastq或fasta、匹配的model文件等，基本命令行如下：

medaka_haploid_variant -r ${ref} -i basecalls.fq -m r941_min_sup_variant_g507 -t 12 -o ${name}_medaka

会在指定目录里产生medaka.annotated.vcf文件。需要注意的是，Medaka一般只能鉴别consensus水平的突变，如果想要鉴别低频的宿主内变异，需要使用其他软件如LoFreq、VarScan2或Bcftools来进行。

3.高阶应用

(1)其他用法

Medaka除上述使用方法外，还支持其他命令行调用方式：

比如medaka consensus和medaka snp或medaka variant连用可鉴别基因组突变，注意调用命令行时medaka与其他命令中间要加空格。

(2)ARTIC分析流程

新冠病毒肆虐全球时，ONT和一些科学家联合发布了针对新冠病毒扩增子测序的分析流程ARTIC，用户可选择使用该流程内置的Medaka软件(主要调用medaka consensus、medaka variant和medaka tools annotate )完成相关分析。

总结

本文简单介绍了Medaka的使用方法，对Medaka的GPU加速和并行计算并未提及，有机会会在以后的文章中继续交流。

今天的文章oxford imagine_maestro制谱软件分享到此就结束了，感谢您的阅读。

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