三代测序~~~Nanopore

转载2020-07-09 17:20:56

标签：三代测序 技术 nanopore

6.3   Nanopore测序

6.3.1  发展历程

化学原理：单链DNA分子穿过蛋白质纳米孔，碱基依次被纳米孔旁边的酶切断，游离碱基穿过纳米孔的时候造成特征性的电位变化，相关信号由半导体器件采集。不同碱基电位变化的图式不同，由此可以识别碱基。主要厂商：Oxford Nanopore公司。

 Nanopore技术从提出原理到走上市场，所耗时间漫长。其发展历程大致如下：

2012年，ONT在基因组生物学技术进展年会（AGBT）上推出掌上型MinION测序仪，轰动一时；但直至2014年才正式推出MinION试用计划。

2016年5月，发布更小的测序仪SmidgION，可连接智能手机，检测DNA和RNA。

2016年底，通过试剂和芯片的不断升级，通量、读长和准确率大幅提升。MinION平台首次完成人基因组测序。相比其他技术动辄上百万、上千万一套的测序仪，ONT测序仪价格低廉。

2017年，发布GridION X5，含有5个流动槽，可同时上机5个芯片，应用于大规模测序项目；PromethION通量更高，含有48个新型flowcell，每个flowcell有3,000个channel，一次 48小时运行可获得6.2 Tb数据。

 除了科研市场火热的基因组测序应用，Nanopore技术在细胞鉴定、食品安全、水质检测、消费者基因检测、生物防御、疫情爆发的调查和监控等领域都可以大展拳脚。在医学应用领域，结合LDA（阅尔基因的BDA技术），可以把Nanopore的灵敏度提高到千分之一，从而可以开展肿瘤ctDNA液体活检，具有速度快的优势。

 6.3.2  MinION测序原理

以MinION为例。MinION的特点是读长超过150 kb，测序速度快，实时监控测序数据，机器便携。

MinION的核心是一个包含2048个纳米孔、分成512组、由集成电路控制的flowcell。测序方法有两种模式：2D和1D。

在文库构建过程中，要在双链DNA分子上连接lead adaptor、hairpin adaptor和trailing adaptor。

在测序过程中，2D方法的主要步骤是：lead adaptor拖着待测DNA链，首先进入由酶控制的纳米孔；然后是待测DNA分子链通过纳米孔，所得测序数据称为template read；hairpin adaptor的作用是DNA双链测序的保证；然后待测DNA分子的互补链通过纳米孔，获得complementread；最后，trailing adaptor通过纳米孔。在上述测序方法中，template read和complement read依次通过纳米孔，利用pairwise alignment软件可以把它们组合成2D read。

1D方法不使用hairpin adaptor，只测序template read，最终形成1D read。1D方法通量比2D高，但是准确性比2D低。

 6.3.3  MinION的优势

1、修饰碱基检测

纳米孔测序技术可以检测4种胞嘧啶(cytosine)碱基修饰，分别为5-methycytosine、5-hydroxymethycytosine、5-formylcytosine和5-carboxylcytosine，准确率为92%-98%。

 2、实时监控测序

实时获取和分析DNA/RNA序列对于临床实践很重要。NGS做不到这一点，但是对于MinION，在测序过程中单分子穿过纳米孔，其电流变化可以实时检测并识别，用户可以在测序过程中根据实时结果相应地做出一些判断。

【云】我觉得吧,实时监控测序数据并没什么卵用。

 3、长读长

MinION测序仪1D模式可以获得300 kb长的read；2D模式可以获得60 kb长的read。长读长有助于基因组组装。研究实例：利用MinION测序产生的长read，研究人员设法填充了人参考基因组中Xq24区域的一个长达50 kb的gap。该区域存在多个CT47基因串联拷贝，利用MinION的长read，判断该区域极有可能存在8个CT47基因拷贝。

 4、结构变异检测

NGS短序列的特征使得它对于结构变异的检测往往不准确。这个问题在癌症检测中尤其严重，因为癌症组织中充斥各种结构变异。研究发现，只要几百条MinION长read，所识别出来的结构变异比上百万条NGS 短read更可靠。

 5、RNA表达分析

对于RNA表达分析，NGS短序列需要进行拼接才能得到转录本，这给可变剪接研究带来困扰。通常NGS测序不能提供足够的信息来区分不同形式的可变剪接。MinION测序产生的长read可以更好地解决这个问题。以果蝇的Dscam1基因为例，其存在18,612种可变剪切形式，MinION测序可以检出超过7,000种可变剪切形式，这是利用NGS短序列测序不能获得的。

 6.3.4  生物信息学配套软件的发展

近年来，随着生物信息分析方法的发展，MinION测序reads成功比对参考基因组的比例已经从66%提升到了92%。相关软件工具包括：

1、碱基识别工具

2、序列比对工具

3、从头组装工具

4、单核苷酸变异(SNV)检测工具

5、一致序列(consensus sequence)运算工具

 6.3.5  MinION测序应用

1、即时检测传染源

尽管NGS也可以在医院环境下进行传染源检测，但是MinION测序方法提供了一种全新的体验。MinION在测序读长、便携性、检测时长等方面具有优势。文献记载从样品准备到鉴定致病菌只需要6小时，从样品上机到鉴定致病菌只需要4分钟。西非爆发埃博拉病毒疫情时，MinION测序对于病毒检测起到过重要作用。

2、非整倍体检测

MinION可以在胎儿非整倍体产前检测中发挥重要作用。NGS通常需要1-3周时间才能获得结果，而MinION测序只需要4小时。

 6.3.6  未来展望

1、提高测序通量

为了满足高通量测序需求，台式纳米孔测序仪PromethION装载有48个flowcell，每个flowcell可以单独运行，也可以并行。每个flowcell包括3000个通道（channel），每天产生6 Tb数据。

 2、提高测序准确性

目前MinION测序的准确率在92%左右。对于致病菌和可变剪切的发掘，这样的准确率可以满足需求。但是临床检测通常需要达到99.99%的准确率。针对随机错误，ONT公司需要优化相关化学和碱基识别软件。

MinION测序也存在非随机的错误。比如MinION不能很好地处理长于6个核苷酸的单一碱基重复，也缺少碱基修饰检测的内参训练。如果这两个问题能够解决，一致序列（consensus）的准确率可以达到大于99.99%的标准。

结合运用阅尔基因的BDA和LDA技术，可以大幅度提高纳米孔测序的准确度。

 3、进一步提高测序读长

三代测序本来就可以获得很长的读长，比如MinION测序的读长已经达到了150 kb。但是这指的是最长读长，而不是所有片段的长度。对于纳米孔测序，需要进一步提高的是一轮测序所得全部片段的平均读长。

 4、RNA直接测序

RNA测序通常离不开逆转录和PCR扩增(RT-PCR)，但是逆转录和PCR扩增会导致很多RNA自身信息的丢失，所以研究机构正在尝试运用纳米孔技术对RNA进行直接测序。研究表明，tRNA可以进行单通道和固态纳米孔（solid-statenanopore）检测，而且纳米孔测序可以检测tRNA的碱基修饰。

来源：陈云地 福禄随笔

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