微生物富集培养方法步骤_微生物富集培养方法步骤

Microbiome杂志2018年12月26日在线发表山东大学海洋学院杜宗军组关于“未培养微生物可培养机制”的文章，在此向杜宗军团队表示祝贺，同时很高兴邀请到第一作者穆大帅副教授亲自为大家带来最原汁原味的解读。

Microbiome：所谓的“富集培养”获得的微生物真的都是被“富集”出来的吗？

第一作者：穆大帅
通讯作者：杜宗军
单位：山东大学

官方新闻稿

转自山东大学(威海)海洋学院官网
https://mc.wh.sdu.edu.cn/info/1005/4558.htm

近日，山东大学（威海）海洋学院杜宗军教授课题组在海洋未培养微生物的可培养机制方面获得新进展，发现微生物富集培养过程中潜藏的复苏机制及其对分离培养难培养微生物的重要性，研究成果“Metatranscriptomic and comparative genomic insights into resuscitation mechanisms during enrichment culturing”发表在微生物学领域著名期刊Microbiome（五年影响因子10.9），文章第一作者为穆大帅副教授，通讯作者为杜宗军教授，山东大学为独立完成单位。

海洋中绝大多数微生物尚不能被现有的培养方法和技术进行分离培养，这些微生物被称为未培养微生物(uncultured microorganisms)，出现这种现象的一个重要原因是天然环境中很多微生物处于休眠状态，该状态是微生物在长期的进化过程中逐渐形成的可逆的低代谢活力的生存模式。因此，复苏环境中休眠的微生物将有助于分离、培养和认识该类群。

富集培养法（Enrichment culture）是微生物分离培养中的一个经典方法，已经有上百年的使用历史，但是对其中的富集和可培养机制的认识仍然非常有限。杜宗军教授课题组设计了新的富集培养基和富集条件，分离出了大量的海洋细菌新类群。在验证了新的富集分离技术有效性的基础上，进一步开展了细菌在富集培养过程中复苏机制的探讨，发现复苏是利用富集培养分离未培养海洋微生物的重要机制。研究还发现富集培养过程中伴随着微生物之间的相互作用，结合宏转录组学和比较基因组学对互作及复苏机制进行深度解析。该分离技术可为微生物的混菌培养提供借鉴，也为今后微生物资源的发掘提供了新思路。

杜宗军教授课题组长期从事海洋微生物资源学工作，创新和改进了细菌分离方法，建立了2个新目，4个新科，24个新属，成为国际上微生物系统学研究领域具有重要影响力的研究团队。第一作者穆大帅副教授2014年博士毕业于南京农业大学并加入至课题组，博士毕业论文曾获“江苏省优秀博士论文”。以上相关研究得到了国家自然科学基金和山东大学微生物技术国家重点实验室的支持。

文章链接：

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-018-0613-2

背景

微生物的纯培养对于人们认识微生物和利用微生物至关重要，但是随着研究的不断深入，人们发现自然界中相当数量的微生物并不能在人工培养基上被纯培养，这也限制了人们对微生物资源的发掘与利用。因此微生物的分离培养一直是微生物学领域的基本问题也是一项难题。近几年随着全球各项微生物组计划的推进，未培养微生物的可培养难题被突显出来。

为培养出更多的微生物物种，近年来研究人员进行了很多尝试，例如培养基的改进、目标微生物的特殊富集、模拟自然环境条件、原位培养和单个细胞的分离培养等。与此同时，一些新的培养方法和培养装置不断地被开发出来，这些新型的培养方法大多基于一个基本原理——模拟微生物的原始生存环境。

尽管目前绝大部分基于“模拟生境”的分离培养策略取得了一定的成效（Nature 528: 364-369 (2015)；Nature 533, 543–546 (2016); Nature Microbiology 1: 16203 (2016)），但是，自然界中很多微生物并不活跃，甚至是处于休眠状态。也就是说，如果只采用模拟原始环境培养自然界的微生物，其中休眠的类群难以苏醒，也难以被分离培养。因此如何唤醒原始生境中休眠的微生物显得尤为重要。

富集培养法（Enrichment culture）在微生物分离培养中是一个经典方法，Winogradsky（1856～1953）很早就建立Winogradsky Column用来富集和研究硫化细菌和硝化细菌。尽管该方法已有上百年历史，但是对其中的富集和可培养机制的认识仍然非常有限。因此本文就富集培养方法进行了系统研究，并发现了其中潜藏的微生物复苏机制。

结果分析

研究人员对威海近海三个不同地点的潮间带进行表层沉积物取样，采用大约1/50浓度的2216E培养基（添加丙酮酸钠和乙酸钠）进行富集培养，随后每隔0天、5天、12天、21天及30天进行稀释、涂布于普通的2216E培养基，置于28°C培养（图1）。

图1 富集培养的流程图

Step 1富集，Step 2涂布分离培养，Step 3物种鉴定及测序，Step 4富集过程样品高通量分析，Step 5将Step 2和3的结果与Step 4结果综合分析

实验共分离获得1251个纯菌，鉴定后属于282个物种，其中包含97个潜在新种（1个新目、1个新科、16个新属和79个新种）。预料之中，不同的富集时期能够获得不同的微生物类群。后对所分离的物种进行系统发育树构建，由于采用的常规2216E培养基分离培养，平皿上所分离的菌也都是常见的四个门（Proteobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes和Actinobacteria）（图2）。

图2 分离培养物种系统发育树构建及富集过程中相对丰度分析

从这里似乎看不出特别的地方，接下来该研究分析了分离培养的菌在富集过程中的丰度是如何变化的（图2）。按照以往经验，“富集培养”容易分离的菌应该在富集过程中表现为相对丰度提高（即“被富集”）。但是结果却截然相反，大量可培养微生物的丰度并未随富集培养改变（图3a），当然像Draconibacterium orientale等一些类群随着富集的进行，丰度显著提高。

图3 微生物富集程度数量统计与微生物活跃程度分析

为了解释这个不寻常的现象，作者想到细菌中的k-策略和r-策略，以及微生物的“复苏”与“休眠”。为了验证上述假设，先采用16S rRNA/16S rDNA来全面评价富集过程中的微生物活跃状态的变化（休眠or活跃），并挑选富集培养分离的相关类群进行深入分析，发现Marinilabiliales中的很多类群富集过程中有复苏的迹象（图3b）。接着又随机挑选了9个富集培养分离的微生物进行了VBNC（viable but non-culturable）诱导处理与富集培养实验，进一步说明富集培养可以促进一些VBNC菌体的复苏。

在用“休眠与复苏”理论解释上述实验现象之后，研究者又对富集培养过程中微生物的基因表达情况进行了分析，以进一步解析可培养机制。宏转录组学分析发现：富集培养前，微生物中参与胁迫应答的相关基因高表达，这些基因也被广泛报道参与VBNC状态的维持；而富集培养后，微生物中参与细胞代谢相关基因获得高表达，表明微生物代谢状态变得更加活跃（图4）。

图4 宏转录组学分析富集过程中微生物相关基因转录情况

同时，针对培养获得的Marinilabiliales类群也做了相应分析，发现丙酮酸钠和乙酸钠可能为细胞生长所需丙酮酸和乙酰辅酶A的做贡献，进而增强细胞基础代谢（图5）。

图5 Marinilabiliales类群相关基因转录分析

考虑到富集培养过程是一个复杂的混菌培养过程，微生物之间的相互作用便不能被忽视。所以作者又从微生物种群互作角度进行了分析，首先基于Network Analysis分析了Marinilabiliales的共现关系类群，基于比较基因组学分析共现关系类群的可能的互作机制。发现B族维生素（biotin and cobalamin）合成途径的互补可能是相关类群出现共线性关系的原因（图6），这种现象符合物种进化过程中的“Black Queen”理论。

图6 比较基因组学分析互作类群Biotin生物合成途径

最后，研究者根据推测的Marinilabiliales类群的复苏机制，优化了培养条件，培养出更多该类群（尝试性工作）。

总结

本实验建立了高效的富集培养技术。该方法在培养难培养微生物时仍然具有很大潜力。
该培养技术在培养微生物时不仅通过富集提高部分微生物丰度，还可通过复苏机制改善微生物培养状态。
富集培养是一种复杂的混菌培养过程，其中包含微生物间的竞争与协作。考虑到将来培养技术由纯培养向混菌培养的发展趋势，我们需要重新认识富集培养，该技术应该发展成为一种模型来研究混菌培养及探索微生物暗物质。

点击文末阅读原文，下载论文PDF全文

猜你喜欢

10000+：菌群分析宝宝与猫狗梅毒狂想曲提DNA发Nature Cell专刊肠道指挥大脑

系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组宏基因组

专业技能：学术图表高分文章生信宝典不可或缺的人

一文读懂：宏基因组寄生虫益处进化树

必备技能：提问搜索 Endnote

文献阅读热心肠 SemanticScholar Geenmedical

扩增子分析：图表解读分析流程统计绘图

16S功能预测 PICRUSt FAPROTAX Bugbase Tax4Fun

在线工具：16S预测培养基生信绘图

科研经验：云笔记云协作公众号

编程模板: Shell R Perl

生物科普: 肠道细菌人体上的生命生命大跃进细胞暗战人体奥秘

写在后面

为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外5000+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。PI请明示身份，另有海内外微生物相关PI群供大佬合作交流。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍末解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。