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- 参考:
【实验技术笔记】利用重组载体做基因过表达(pCDH 载体)
载体构建实例解析——构建 SETD3-pEGFP-N1(Snapgene 设计引物)
干货 | 寻觅基因启动子,UCSC&Ensembl来助威!
1. siRNA/shRNA 的 RNAi 操作流程
- siRNA:约 21-25 个核苷酸 的双链 RNA。
① RNA 干扰:在细胞内被装配进 RNA 诱导的沉默复合物 RISC,切割 mRNA,促使 mRNA 降解。切割位点是与 siRNA 反义链互补结合的两端。
② 作为引物,与目的 DNA 结合,产生大量 siRNA,放大 RNA 干扰的作用。 - 可以把特定的
siRNA
用脂质体或病毒导入细胞,但 siRNA 只能实现瞬时转染,只能作用两三天,之后就会被降解,且 siRNA 的干扰效果不一定能很显著; - 也可以把 siRNA 的前体 shRNA(短发夹 RNA)导入细胞,shRNA 在细胞内被切割成 siRNA,从而发挥基因沉默作用。shRNA 表达载体除了可以单独瞬时转染发挥短期作用以外,还可以和病毒包装质粒配合使用,可以包装出病毒(慢病毒、腺病毒等),感染细胞后能够通过抗性基因筛选,获得稳定表达该 shRNA 的细胞系,也就是能够稳定敲减目的基因的细胞系。
- 现在国内公司能快速廉价地定制 siRNA化学合成片段,我们完全可以在筛选有效干扰片段时使用化学合成的 siRNA,在需要长期稳定地表达 siRNA 时,将相应的 shRNA 装入载体来实现这一目的。
- RNAi 技术的重点在 siRNA 设计。
- RNAi 操作流程:
1、siRNA 设计
2、shRNA 退火
3、酶切并回收载体片段
4、连接载体和 shRNA 片段
5、转化
6、挑取克隆并鉴定
7、扩大培养阳性克隆,抽提质粒
2. siRNA 设计
2.1 设计途径
- 1、文献中找:寻找已经验证过的(首选)
- 2、预设计的 siRNA 库:包含已经验证过的 siRNA 片段
- 3、软件设计:BLOCK-iTTM RNAi Designer、siRNA at WHITEHEAD(blast 库很久没更新,备选)
一般的设计:AA(N19)TT
2.2 预设计的 siRNA 库
- https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/sirna
- 使用方法:在搜索框中输入基因名字搜索(以 TP53 为例)→点击左侧的 shRNA 快速查找→点击 shRNA,出现列表,设置筛选条件,查看详情→ 多选几个 标记了【已验证】的干扰靶点以排除脱靶效应(只靶向目的序列的概率很低,可能会结合到其他未知 mRNA 上导致目的 mRNA 没有变化,或结合到未知 mRNA 上导致目的 mRNA 沉默)。
- Sigma shRNA 结构分析 (现在只显示靶序列)
◆ polyT 的作用:转录时酶遇到 polyT 停下,转录终止;shRNA 加工时读到第二个 T 后被切割成 siRNA, siRNA 带 TT 有助于装配进 RISC 复合物。
◆ 可以利用 DNAMAN 查看 shRNA 的二级结构。例如:CCGGCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGTTTTTG,序列保存成 .seq 文件,导入 DNAMAN → Sequence → Sequence Structure → Current Sequence → OK。
2.3 使用在线软件设计 siRNA
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BLOCK-iTTM RNAi Designer 选择 siRNA 选项(现在没有了,可以选Stealth RNAi™ siRNA、shRNA等,使用方法相同)
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1、输入靶基因的 Accession number(如:NM_000594.4,现在无效) 或靶基因CDs序列。
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2、如果输入的是 Accession number,选择靶序列区域,默认 ORF(CDs 序列)。
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3、选择种属。
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4、其他默认,点 RNAi Design。
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5、生成的引物中选择星号多的,BLAST 一下,如果跟其他基因有超过 15 个碱基一样的要排除掉。
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设计好的靶点可以用于:
◆ 订购化学合成的 siRNA,直接导入细胞做 RNA 干扰。正义链即为软件筛选出来的序列,反义链为反向互补序列并在 3’ 端加 UU 或 dTdT。
◆ 构建 shRNA 重组载体。
3. 构建 shRNA 重组载体
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Sigma 直接提供的 shRNA 产品用的是
pLKO.1-puro
载体。
◆ 用的启动子是 U6 启动子。U6
或H1
是三型启动子,启动短序列,如 shRNA。
◆ 构建稳转株建议用二型启动子,如CMV
、EF1
启动子,启动效率更高,可以有组织特异性,可以选择组织特异性的二型启动子来启动。 -
1、按 shRNA 框架设计:
◆ 前面的酶切位点是AgeⅠ
的插入片段粘性末端。
◆ 后面的酶切位点是EcoRⅠ
的插入片段粘性末端。
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2、合成 Oligo:
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3、退火:
◆ 退火体系:
◆ 退火条件:98℃ 5min,自然冷却至室温。 -
4、进行后续连接、转化、阳性克隆筛选等步骤。
今天的文章基因沉默vigs_sirna和shrna转染区别分享到此就结束了,感谢您的阅读。
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