基因沉默vigs_sirna和shrna转染区别

文章目录

1. siRNA/shRNA 的 RNAi 操作流程
2. siRNA 设计
3. 构建 shRNA 重组载体

参考：
【实验技术笔记】利用重组载体做基因过表达（pCDH 载体）
载体构建实例解析——构建 SETD3-pEGFP-N1（Snapgene 设计引物）
干货 | 寻觅基因启动子，UCSC&Ensembl来助威！

1. siRNA/shRNA 的 RNAi 操作流程

siRNA：约 21-25 个核苷酸 的双链 RNA。
① RNA 干扰：在细胞内被装配进 RNA 诱导的沉默复合物 RISC，切割 mRNA，促使 mRNA 降解。切割位点是与 siRNA 反义链互补结合的两端。
② 作为引物，与目的 DNA 结合，产生大量 siRNA，放大 RNA 干扰的作用。
可以把特定的 siRNA 用脂质体或病毒导入细胞，但 siRNA 只能实现瞬时转染，只能作用两三天，之后就会被降解，且 siRNA 的干扰效果不一定能很显著；
也可以把 siRNA 的前体 shRNA（短发夹 RNA）导入细胞，shRNA 在细胞内被切割成 siRNA，从而发挥基因沉默作用。shRNA 表达载体除了可以单独瞬时转染发挥短期作用以外，还可以和病毒包装质粒配合使用，可以包装出病毒（慢病毒、腺病毒等），感染细胞后能够通过抗性基因筛选，获得稳定表达该 shRNA 的细胞系，也就是能够稳定敲减目的基因的细胞系。
现在国内公司能快速廉价地定制 siRNA化学合成片段，我们完全可以在筛选有效干扰片段时使用化学合成的 siRNA，在需要长期稳定地表达 siRNA 时，将相应的 shRNA 装入载体来实现这一目的。
RNAi 技术的重点在 siRNA 设计。
RNAi 操作流程：
1、siRNA 设计
2、shRNA 退火
3、酶切并回收载体片段
4、连接载体和 shRNA 片段
5、转化
6、挑取克隆并鉴定
7、扩大培养阳性克隆，抽提质粒

2. siRNA 设计

2.1 设计途径

1、文献中找：寻找已经验证过的（首选）
2、预设计的 siRNA 库：包含已经验证过的 siRNA 片段
3、软件设计：BLOCK-iTTM RNAi Designer、siRNA at WHITEHEAD（blast 库很久没更新，备选）
一般的设计：AA（N19）TT

2.2 预设计的 siRNA 库

https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/sirna
使用方法：在搜索框中输入基因名字搜索（以 TP53 为例）→点击左侧的 shRNA 快速查找→点击 shRNA，出现列表，设置筛选条件，查看详情→ 多选几个 标记了【已验证】的干扰靶点以排除脱靶效应（只靶向目的序列的概率很低，可能会结合到其他未知 mRNA 上导致目的 mRNA 没有变化，或结合到未知 mRNA 上导致目的 mRNA 沉默）。
Sigma shRNA 结构分析 （现在只显示靶序列）

◆ polyT 的作用：转录时酶遇到 polyT 停下，转录终止；shRNA 加工时读到第二个 T 后被切割成 siRNA, siRNA 带 TT 有助于装配进 RISC 复合物。
◆ 可以利用 DNAMAN 查看 shRNA 的二级结构。例如：CCGGCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGTTTTTG，序列保存成 .seq 文件，导入 DNAMAN → Sequence → Sequence Structure → Current Sequence → OK。

2.3 使用在线软件设计 siRNA

BLOCK-iTTM RNAi Designer 选择 siRNA 选项（现在没有了，可以选Stealth RNAi™ siRNA、shRNA等，使用方法相同）
1、输入靶基因的 Accession number（如：NM_000594.4，现在无效）或靶基因CDs序列。
2、如果输入的是 Accession number，选择靶序列区域，默认 ORF（CDs 序列）。
3、选择种属。
4、其他默认，点 RNAi Design。
5、生成的引物中选择星号多的，BLAST 一下，如果跟其他基因有超过 15 个碱基一样的要排除掉。
设计好的靶点可以用于：
◆ 订购化学合成的 siRNA，直接导入细胞做 RNA 干扰。正义链即为软件筛选出来的序列，反义链为反向互补序列并在 3’ 端加 UU 或 dTdT。
◆ 构建 shRNA 重组载体。

3. 构建 shRNA 重组载体

Sigma 直接提供的 shRNA 产品用的是 pLKO.1-puro 载体。

◆ 用的启动子是 U6 启动子。U6 或 H1 是三型启动子，启动短序列，如 shRNA。
◆ 构建稳转株建议用二型启动子，如 CMV、EF1 启动子，启动效率更高，可以有组织特异性，可以选择组织特异性的二型启动子来启动。
1、按 shRNA 框架设计：
◆ 前面的酶切位点是 AgeⅠ的插入片段粘性末端。
◆ 后面的酶切位点是 EcoRⅠ的插入片段粘性末端。
2、合成 Oligo：
3、退火：
◆ 退火体系：

◆ 退火条件：98℃ 5min，自然冷却至室温。
4、进行后续连接、转化、阳性克隆筛选等步骤。