点成分享丨细胞培养三步骤——复苏、传代、冻存

细胞培养是指在体外模拟生物体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。

细胞培养也叫细胞克隆技术，是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。

细胞培养的具体步骤可分为：细胞复苏、细胞传代、细胞冻存

一、细胞复苏

1. 细胞复苏的原则：快速融化

在复苏细胞时必须遵循快速融化的原则，即必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至 37 ℃，因为这样可使冻存时细胞外的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

2. 细胞复苏操作过程

二、细胞传代

1. 细胞传代中遇到的问题及解决方案：

（1）传代密度过高

一旦细胞养太久至融合度过高（>90%）才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。（如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象）

解决方案：尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。

（2）传代密度低

哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。

解决方案：细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度。

2. 细胞传代操作过程：

三、细胞冻存

1. 细胞冻存的基本原理：慢冻

(1) 手动降温

将细胞依序放在4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。

(2) 程序降温盒

是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器（填充异丙醇或依靠特制金属导热），使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。

(3) 免液氮程序降温仪

一种新型自动化程序降温方法，通过微处理器精确控制冷却速率和样品温度，能够控制样品线性/非线性降温，能够有效减少冻融过程对于细胞或组织的伤害，重现性好，降温过程可控，成本低。（例如点成生物CRF-1免液氮程序降温仪）

2. 细胞冻存操作过程：

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点成CRF-1免液氮程序降温仪

降温仪顶盖打开示意图

点成CRF-1免液氮程序降温仪台式设计，外形精巧，操作简单，有无PC连接都可进行；数据可以通过PC软件进行记录，冷却数据将直接显示在PC屏幕上，CRF-1的冷冻能力可达零下100℃(采用细管时)。CRF-1精准控制降温速率，从而确保整个冷冻过程中温度的精确性和重现性，尤其是在重要的成核/播种阶段，这就确保了细胞解冻后的最佳恢复。

内置多种降温程序，例如胚胎、生殖细胞、干细胞等降温程序，用户也可自定义降温过程，广泛应用于多种样品的冷冻保存。

精确控制冷却速率和样品温度，重现性好
使用方便简单，样品可原位成核/播种
可实现线性和非线性降温方案
运行成本低：约为液氮降温仪的1%

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点成生物与多家先进的国际仪器制造商（Grant、Nuve、Cellix、Microfluidic ChipShop、Beonchip、Drucker等）进行深度合作，专注于生命科学、温度控制、临床应用、微流控等领域；提供的产品有水浴、摇床、混匀器、离心机、移液枪、恒温振荡器、培养箱、蒸馏水机、程序降温仪、微流控芯片及分析系统等常用实验仪器；致力于生物科技领域产品和解决方案。

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点成分享丨细胞培养三步骤——复苏、传代、冻存

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