qRT-PCR相对定量计算详解qPCR相对定量计算方式——2^-(∆∆Ct) deta t

做完转录组分析之后，一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法，他的计算方法有很多，常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法，ΔCt法，2^-ΔΔCt法(Livak法)，用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。这里主要讲解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何计算；

qRT-PCR原理：
以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。

Ct值是什么意思呢？
Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。 qRT-PCR在扩增的时候都会有平台期，在平台期之前，PCR 扩增就是简单的指数增长，也就是 1 变 2，2 变 4，4 变 8 …扩增。数学形式就是 2 的 ct 次方，到了平台期所有基因扩增的数目是一致的，而唯一有区别的则是 ct 值的不同。所以不难推断出 ct 值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高。这里可以得到公式：

计算-ΔΔCt

在这里，我们有一个对照组，一个处理组，还有一个内参基因和目的基因，想看一下目的基因在处理组中相对与对照中的表达差异，也就是计算-ΔΔCt：数据如下：

1.计算每组内参基因sgAction Ct均值

2.计算第一个 Δct，即每组的待检目的基因减去内参基因的 Ct 值

3.计算对照CK组中 Δct 的均值，再用处理组的 每一个Δct 减去刚刚计算的对照CK组的 Δct 均值，得到 ΔΔct（红框框）

4.相对表达量计算，也就是相对于对照组: 2^-ΔΔct：

不难看出这里的-ΔΔct和我们转录组当中的log2（fold change）值是一致的，所以如果多做几个基因就可以绘制类似如下图：

或者相关性点图：

方法二：

qPCR疑问解答：

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2–∆∆Ct 是一种计算实时荧光定量PCR（qPCR）时候计算样品中某个基因的相对表达量的方法。该法由Kenneth Livak和Thomas Schmittgen于2001年设计，已经被广泛使用。

Ct值代表了样品的循环阈值，这是在跑荧光定量PCR的时候，机器反馈给你的一个数值。真正的含义是PCR过程中产物扩增出现的荧光信号达到了设定的阈值之后，对应的循环数。例如 Ct = 19，说明这个产物扩张到第19个循环的时候才达到了设定的荧光阈值。也就可以侧面反映这个PCR时候模板的起始浓度，浓度越高，Ct值出现得越低。

delta：意思是两个值之差

上面的公式就是用实验组的 ΔCt 减去 空白组的 ΔCt得到的 ΔΔCt 。

而 ΔCt 由以下公式得到：

管家基因，也就是内参基因。ΔCt是用目的基因的Ct减去内参基因得到的差值。

什么是管家基因/内参基因？一般是指不受时空等其他因素影响，始终能稳定高表达的一类基因。常用的有β-Actin、GAPDH、18S、UBQ、EF-1α、TIP41。

• β-Actin：β-肌动蛋白
• GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶
• 18S：18S核糖体RNA
• EF-1α：延伸因子-1α
• UBQ：泛素酶

如果你有一个内参基因，可以参照以下案例进行计算：

这是一份具有两个重复的qPCR的Ct值，分别为Ct1和Ct2，housekeeping gene为管家基因，另一个是你需要研究的基因。

1. 平均化技术重复的Ct值。则求每个样品的Ct1和Ct2的平均值，可得：

2. 计算每个样品的ΔCt值。如Control 1（空白对照组1）的ΔCt为：

所有样品的ΔCt值如下：

3. 选择一个校准/参考样品用来计算ΔΔCt

用哪个样品或者样品组作为校准或参考，这一步会迷惑许多人，但其实取决于你的实验设置。

一般来说你可以将任意一组作为校准/参考都是可以的，也就是说你用Control或Treated，但是一般我们会用空白对照组为标准，研究实验处理的基因表达量变化。或者如果是研究不同品种之间的基因表达量，一般不用研究的那个品种作为标准。

还有一种方法就是选择用Ct值较高的一组作为参考组。

这里选择用Control组的生物学重复计算平均的ΔCt值作为参考，也就是：

值得注意的是，如果在计算平均ΔCt的时候，每个ΔCt变化较大，这时候不建议用算数平均值，而选择用几何平均值，这样会更好处理我们的异常值。例如这里的Control组Ct值是：13.38、13.60和15.80时，我们选择用几何平均值：

4. 计算ΔΔCt值。用每个样品所得的ΔCt减去第三步的平均ΔCt。

5. 计算 2^-(∆∆Ct)值，即为每个基因的相对表达量

最后在统计分析的时候，直接使用 2^-(∆∆Ct)值进行分析可能不会呈现正态分布且偏态严重，这时候可以用log公式进行转化，再进行后续的统计分析。即：log( 2^-(∆∆Ct))。

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